Primena multidomenskih proteinaza bakterija mlečne kiseline u biotehnologiji

Abstract

Bakterije mlečne kiseline (BMK) poseduju multidomenske proteinaze vezane za ćelijski zid (CEP) koje se smatraju odgovornim za početnu degradaciju kazeina. Do sada su iz BMK klonirana i sekvencirana četiri različita tipa gena koji kodiraju CEP, a označeni su kao prtB, prtH, prtP i prtR. Komparativna analiza u kojoj su korišcene metode kao što su poređenje više nukleotidnih i proteinskih sekvenci, analiza sekundarnih struktura i pretraživanje homologija u baza podataka, dovela je do pretpostavke o postojanju različitih domena u CEP. Ovi domeni uključuju, počevši od N-terminusa, pre-pro-domen za sekreciju i aktivaciju, katalitički domen serinske proteaze, dva velika središnja domena A i B, nepoznate funkcije koji verovatno imaju regulatomu funkciju, helikazni domen, domen vezan za ćelijski zid i domen za "usidrenje". Poznavanje domenske strukture i funkcije CEP može da bude iskorišceno u biotehnologiji. Hibridni enzimi mogu da budu formirani rekombinacijom CEP domena poreklom iz različitih vrsta BMK. Konstruisani hibridi treba da dovedu do poboljšanja stabilnosti ili vezivanja za ćelijski zid, a mogli bi da se selektuju i oni kod kojih je došlo do promenjene supstratne specifičnosti. Na površinu ćelijskog zida mogu biti dodata potpuno nova svojstva spajanjem drugih proteina sa CEP. Antigeni vakcina su klonirani u proteinazni domen PrtP proteinaze da bi bili transportovani na površinu ćelije. Na sličan način bi- takođe mogli biti klonirani i razni drugi domeni sa željenim svojstvima. Konačno, promotori CEP su regulisani koncentracijom dipeptida u medijumu za rast bakterija i mogu biti korišćeni za konstruisanje genskih fuzija u cilju kontrolisane ekspresije heterologih gena.

Multi-domain cell-envelope proteinases (CEPs) are generally considered as responsible for the initial breakdown of casein by dairy lactic acid bacteria (LAB). Four distinctly different types of genes encoding CEPs have been cloned and sequenced from LAB referred to as prtB, prtH, prtP and prtR. The comparative analysis using multiple sequence alignment, secondary structure prediction and database homology searching methods has led to the prediction of a number of different domains in CEPs. These domains include starting from the N-terminus, a pre-pro-domain for secretion and activation a serine protease domain, two large middle domains A and B of unknown but possibly regulatory function, a helical spacer domain, a hydrophilic cell-wall spacer or attachment domain, and a cell-wall anchor domain. The present knowledge of domain structure and function in CEPs could be exploited in biotechnology. Novel hybrid enzymes could be formed by recombination of the domains from different LAB species. Hybrids formed from more distantly related CEPs could lead to improved stability or cell-wall attachment, and presumable also to altered substrate specificity. Entirely new properties could be added to the surface of lactic acid bacteria by coupling other proteins to these CEPs. The vaccine antigens have been introduced into the protease domain of PrtP, to be transported to the cell surface. Other domains with desired properties could be added in similar way. Finally, promoters of CEPs are regulated by presence of dipeptides in the growth medium and could be used to construct gene fusions with heterologous genes for controlled expression.